都是蚂蚁，“脑回路”为啥不一样？Nature子刊：华大自主平台助力构建蚂蚁全品级大脑单细胞图谱
一个成熟的典型蚂蚁群体内至少存在4种不同的品级，分别是工蚁（Worker）、雄蚁（Male）、处女繁殖蚁（Gyne）及蚁后（Queen）。工蚁一般卵巢完全退化，终身从事育幼、觅食等工作，没有繁殖能力；雄蚁离开巢穴找到心仪的蚁后进行交配，交配后很快生命就结束了；处女繁殖蚁成功交配后成为蚁后，蚁后长期待在巢内，专职产卵；而错过交配窗口期的处女繁殖蚁，其行为会逐渐偏向工蚁，从事部分育幼及觅食工作。
那蚁群为什么会这样分工呢？实际上，蚁群复杂的社会行为是由各自神经环路的基因调控网络决定的。已有研究通过转录组学鉴定了蚂蚁部分品级间的差异表达基因，但对蚂蚁所有品级大脑的细胞组成异质性和细胞群体间基因表达差异仍缺乏认识，对不同品级的脑部特化神经基础了解不足。
2022年6月16日，华大自主单细胞DNBelab C系列平台助力深圳华大生命科学研究院联合中国科学院昆明动物研究所、丹麦哥本哈根大学等单位于《自然—生态与演化》（Nature Ecology & Evolution，影响因子19.1）发表题为“A single-cell transcriptomic atlas tracking the neural basis of division of labor in an ant superorganism”的文章，构建了法老蚁四种不同品级的大脑单细胞图谱，揭示了蚂蚁伴随着社会分工而出现的脑部特化现象和行为模式差异的神经基础。
样本设计
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选用社会性昆虫研究的模式物种——法老蚁作为研究对象，采用DNBelab C系列单细胞分选平台，对来自4种不同品级（蚁后、处女繁殖蚁、工蚁和雄蚁）的法老蚁的17个样本 [处女繁殖蚁（4）、蚁后（4）、雄蚁（4）和工蚁（5）] 的大脑，进行高通量单细胞核转录组研究，共获得206,367个单细胞核。
技术点睛
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1
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样本选择全面
该研究选取了法老蚁的所有成年表型作为研究对象，能更全面揭示法老蚁群大脑神经发育图谱。
2
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跨物种对比
对比法老蚁和果蝇的脑细胞组成，确定与法老蚁生活习性相关的关键差异细胞类群；比较法老蚁与多种远缘膜翅目谱系的转录相似性，探究Kenyon细胞（KCs）的进化起源。
3
●
性别和品级等多维度对比
通过比较不同性别（雄蚁对处女繁殖蚁、蚁后、工蚁）和不同品级（处女繁殖蚁与蚁后）之间的细胞组成和功能差异，阐述不同表型法老蚁的神经环路特化和互补机制。
技术路线
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图1 技术路线
研究结论
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01
四种品级法老蚁的大脑转录组图谱
通过降维聚类分析，将法老蚁大脑分为43个细胞簇。基于果蝇和膜翅目物种的已知Marker基因，法老蚁大脑中注释到包括KCs、嗅觉投射神经元（Olfactory projection neurons，OPNs）、单胺能神经元、星形胶质细胞等细胞类型。
而视叶（Optic Lobe，OL）细胞缺乏成熟Marker基因，于是研究人员基于同源基因的转录相似性，运用跨物种映射分析，将法老蚁、果蝇和跳蚤的单细胞转录组数据通过MetaNeighbor工具聚类后，使用AUROC评分来量化物种间细胞簇的成对相似性，最后成功将法老蚁中6个簇注释为OL神经元。
图2 蚂蚁大脑单细胞转录组实验设计和细胞图谱组成
02
法老蚁和果蝇大脑的细胞组成差异
对细胞聚类注释后，通过对比分析法老蚁和果蝇大脑细胞组成差异，发现法老蚁的KC（蘑菇体的固有神经元-KCs是昆虫的联想学习和记忆中心）类型比例显著高于果蝇。除此之外，OPN作为将嗅觉信息从触角叶传递到更高嗅觉中枢的神经元，在法老蚁中的平均相对丰度是果蝇的三倍。高丰度的KC和OPN可能与法老蚁在地面和地下生活的习性相关。
图3 法老蚁和果蝇大脑的细胞组成差异
03
蘑菇体KCs的组成差异和进化起源
一般情况，蘑菇体KCs高表达Pka-C1、trio等，此次研究通过Pka-C1的RNA原位杂交（ISH）可以标记到法老蚁中KCs，并根据基因表达模式差异，将鉴定到的12个KCs细胞簇被分为两大类：A类和B类。在三种雌性表型中，A类KC几乎是B类KC的两倍，而在雄蚁脑中的含量略低于B类KCs。KC间差异基因的功能富集分析表明，A类KC中上调cGMP和cAMP介导的信号，涉及记忆、学习和进食行为，而B类KC上调趋化运动、昼夜节律和神经发生的信号。
为了探究法老蚁KC亚型的进化起源，采用AUROC得分评估了法老蚁与Harpegnathos（一个早期分支的蚂蚁谱系）、蜜蜂和果蝇等远缘膜翅目谱系中KC簇的转录相似性。结果发现法老蚁两类KC簇与蜜蜂和Harpegnathos的非常相似，表明这两类KC是在膜翅目复杂的社会生活出现之前进化的。进一步分析发现在Harpegnathos和法老蚁中有三个A类KC亚簇最为相似，表明这三个亚型可能在蚂蚁进化早期建立起来的。
图4 法老蚁大脑中KCs的多样性和进化起源
04
OL细胞的组成差异与行为调控
此项研究中发现，所有法老蚁OL神经元簇与果蝇中至少一种OL细胞亚型高度转录相似，表明OL神经元的功能十分保守。与其他成年表型相比，所有 OL簇在雄蚁脑中丰度较高，其中c16簇最高。进一步采取差异基因GO富集分析，发现c16中上调与雄性求偶行为相关的基因。同时采用ISH检测也证实了工蚁中不存在c16，且雄蚁中c16丰度最高。综上说明，OL神经元细胞群可能在调节昆虫雄性交配行为中起着保守作用，在高度专业化的雄性蚂蚁中尤为重要。
在雌性表型中，除了c20在蜂后中同样丰富，其他OL簇在处女繁殖蚁中的丰度最高。c20中上调了参与果蝇昼夜节律调节的基因，这表明尽管蜂后大多时候在黑暗的巢穴中工作，但保留了一些视觉相关的功能，可能与蜂后评估巢穴萌芽扩散的最佳时间，并在巢穴受到意外干扰时快速退回黑暗的内巢有关。
图5 法老蚁与果蝇之间的OL神经元保守性
05
四种法老蚁大脑的特异化与功能互补
为了研究蚁群不同成员间的大脑分化程度，研究人员采用scCODA分析工具进行评估，比较了四种成年法老蚁脑中不同细胞类型的相对丰度，发现高达86%（37/43）细胞簇的丰度在不同表型之间存在显著差异：性别之间的差异最大（雄蚁对处女繁殖蚁/蚁后/工蚁），其次是品级之间的差异（工蚁对处女繁殖蚁/蚁后）。相反，果蝇任何细胞簇的丰度在不同性别之间都没有显著差异。这些情况证实了法老蚁的不同性表型和品级表型在很大程度上是发育特化的。
另外，与雌性表型相比，雄蚁大脑中所有OL簇和三个星形胶质细胞簇的丰度最高，而OPN和几乎所有KC相关簇的丰度最低，说明雄蚁可能严重依赖视觉引导行为。工蚁大脑的细胞丰度特征则与雄蚁大脑相反，这表明学习、记忆和处理嗅觉信息对工蚁行为更为重要。基于以上数据研究人员预测，工蚁脑中应具有最大的蘑菇体和触角叶，而雄蚁脑则具有相对体积最大的OL。以上预测通过共焦显微镜图像堆栈重建四种成年表型的主要神经细胞得到证实。
图6 四种表型大脑的特化与互补
06
处女繁殖蚁与蚁后大脑之间的细胞类群差异和多巴胺神经环路重塑
研究人员将处女繁殖蚁与成熟蚁后的大脑进行比较，发现c38簇在蚁后大脑中的含量明显增加，它优先表达ple（编码多巴胺合成中的限速酶）和DAT（多巴胺转运蛋白），表明c38主要代表多巴胺能神经元，可能与受精引发的多巴胺回路活性升高有关。处女繁殖蚁的体外左旋多巴给药试验也证实，在其受精后转变为蚁后期间或之后，多巴胺具有促性腺功能。
多巴胺通过表达多巴胺受体的下游神经元发挥作用。与果蝇相似，法老蚁基因组编码Dop2R等，而Dop2R在c19神经元中高度表达。且与处女繁殖蚁相比，蚁后中该簇的丰度显著增加。该簇还高表达Dh31等，说明包括主要产生利尿激素的肽能神经元。最近也有研究发现Dh31神经元敲低导致果蝇产卵量显著减少。综上而言，多巴胺可能通过法老蚁中表达Dh31的c19神经元介导受精诱导的促性腺功能。
图7 处女繁殖蚁和蚁后大脑的细胞组成差异
科技君点睛
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与果蝇不同，蘑菇体KCs在法老蚁中大量存在，并且表现出高度的多样性，其中大多数亚型在工蚁大脑中富集，而负责处理视觉信息的视叶细胞在工蚁大脑里的含量则很低。雄蚁与工蚁脑细胞组成的趋势相反，处女繁殖蚁和蚁后的大脑细胞类型则相对“正常”。研究团队还将处女繁殖蚁与成熟蚁后的大脑进行比较，发现视叶细胞的含量在蚁后大脑中明显降低，这与蚁后长期适应黑暗的巢内环境相关；而多巴胺细胞的含量则在蚁后脑中显著增加，发挥促性腺功能。永久品级和性别分化导致了蚂蚁大脑细胞类群和神经回路的特异性变化。
原文链接（点击文末“阅读原文”即可查看）：
https://doi.org/10.1038/s41559-022-01784-1
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